脂肪酸去饱和酶代表一类氧依赖性酶，正在脂肪酸分别职位引入双键，将饱和脂肪酸降饱和为不饱和脂肪酸食品，催化脱饱和反映，从而爆发单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸。行动脂肪酸合成途径中的环节酶出席脂肪酸的合成，对微生物脂肪酸双键职位、组织、数目爆发特异性影响，不单能够添补脂肪酸的不饱和度，又有利于督促脂质积蓄，对支持生物膜寻常组织和功用拥有紧急意旨。讨论标明，不管是单表达依然共表达去饱和酶基因，都可正在必定水平上提升微生物的油脂含量、改观其饱和、不饱和脂肪酸的构成比例。

　　枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HB1310是1 株已报道的高产油核桃内生菌，饱和酶是该菌株脂肪酸合成途径中的环节酶之一，安徽工程大学的叶景、徐思远、张琴*等人将克隆其去饱和酶基因de1、de2，竣工这两种基因正在i BL21（DE3）中的单表达与共表达，探究去饱和酶基因过表达对E.coli油脂产量及其脂肪酸组分的影响，获取高效的产油工程菌，以期为高产油工程菌的开荒和运用供应身手维持。

　　采用1.0%琼脂糖凝胶电泳对 de1、 de2、 de基因的PCR扩增产品举行检测，结果如图1所示。从电泳图可看出，3 个基因的PCR扩增产品碱基长度约1 036、822、1 856 bp，与预期宗旨条带巨细相符，标明这些基因片断扩增得胜。

　　重组表达质粒pET-28a-de1、pET-28a-de2、pET-28a-de抽提纯化，分辨采用节造性内切酶EcoR I/Xho I、BamH I/Xho I、BamH I/Xho I双酶切，琼脂糖凝胶电泳结果显示，各重组表达质粒酶切后均爆发两条带（图2），此中大片断均与质粒pET-28a单酶切片断长度相同，幼片断分辨与de1、de2im电竞、de基因的目标片断长度相同，进一步测序结果说明3 个基因的重组表达质粒均修筑得胜。

　　将重组质粒转化至BL21（DE3）取得工程菌株BL21（DE3）/pET-de1（DE1），BL21（DE3）/pET-de2（DE2）及共表达菌株BL21（DE3）/pET-de（DE），对工程菌株举行PCR检测、质粒及酶切验证，序列比对结果显示工程菌修筑得胜。

　　3 工程菌株DE1、DE2、DE去饱和酶基因诱导表达产品的SDS-PAGE剖析

　　对工程菌株DE1、DE2、DE去饱和酶基因诱导表达的酶卵白举行SDS-PAGE检测，结果见图3。与 E. coli BL21（DE3）的卵白SDS-PAGE结果举行比较剖析，呈现工程菌株DE1、DE2的重组酶正在分子质料约40、32 kDa独揽的条带分辨较 E.coli BL21（DE3）清楚加深，与表面分子质料较逼近（DE1的为39.8 kDa，DE2的为31.8 kDa）。结果标明，去饱和酶基因 de1 、 de2 正在 E.coli BL21（DE3）中竣工了高效单表达和共表达。

　　对工程菌株DE1、DE2、DE造就6 0 h内的OD 600nm 举行监测，其滋长弧线 h独揽达滋长峰值，其后滋长趋于不变。从造就历程的滋长弧线 株菌株出现与野生菌株相似的滋长弧线，注脚表源的去饱和酶基因 de1 、 de2 单表达和共表达历程中，工程菌株仍能支持有用的滋长。然而，24～60 him电竞，工程菌株的滋长均略低于野生菌株，可以因为表源基因表达历程中，插入新的酶会变成合成代谢扰乱内源性代谢，合成代谢和内源性代谢之间的逐鹿导致代谢承担，从而导致宿主的应激反映和心理转变，惹起工程菌株滋长量的消浸。

　　红四氮唑行动一种氧化剂，能够从去饱和酶接收电子，后自己从无色被还原为赤色的甲攒，从而能够表征细胞内去饱和酶活性。工程菌株和野生菌株60 h内的酶活性转变弧线、DE的去饱和酶活性正在60 h诱导历程中均高于野生菌株，尤以24 h的酶活性最高，分辨为同工夫野生菌株的1.38食品、1.48 倍和1.75 倍，标明去饱和酶基因 de1 、 de2 正在24 h内即竣工了高程度的表达；24 h后工程菌株酶活性呈低浸趋向，可以是因为表源基因的过表达导致 E.co li 中造成洪量的宽恕体。而发酵后期跟着养分物质打发以及细菌滋进步入衰弱期 ，去饱和酶活性趋于安稳，但仍略高于或与野生菌株的酶活性逼近。

　　6 去饱和酶基因de1、de2单表达和共表达对油脂产量及脂肪酸组分的影响

　　为最大水平清除可以因为宽恕体的造成导致片面菌株去饱和酶活性低浸，而变成后续测验对细菌脂肪酸产量及脂肪酸构成因素的测验误差，本讨论仅搜聚了工程菌株和野生菌株发酵24 h的菌体样品举行细菌油脂的提取及其脂肪酸组分剖析。

　　如图6所示，去饱和酶基因的表达有用加强了细菌脂质的积蓄，与野生菌株比拟，工程菌株的油脂产量和质料分数均明显提升。DE1、DE2、DE的油脂产量分辨可达0.57、0.58、0.72 g/L，均较野生菌株提升83%以上，而油脂质料分数从野生菌的9.45%提升至18.44%以上，分辨较野生菌株提升97.78%、95.17%、135.09%。总的来看，去饱和酶基因 de1 与 de 2 共表达对油脂产量和含量提升的督促效用明显优于这两个基因单表达的，这与Yan Fengxin等正在解脂耶氏酵母表达Δ12和Δ15去饱和酶基因督促脂质积蓄效益更明显的结论相同。

　　将提取的细菌油脂举行甲酯化后，运用气相色谱对脂肪酸组分举行定性和定量剖析。基于37 种脂肪酸甲酯混标对油脂样品举行分辩定性，比照准绳品参考图谱得出各组分的出峰期间，采用十五烷酸甲酯行动内标对脂肪酸甲酯举行定量剖析。菌株脂肪酸组分及其质料分数见表3。

　　表3显示，E.coli BL21（DE3）的油脂脂肪酸组分以棕榈酸（C16:0）和硬脂酸（C18:0）为主，其次为豆蔻酸（C14:0）、亚油酸（C18:2）。3 株工程菌中油脂脂肪酸仍以上述4 个组分为主，但各组分的质料分数却产生了清楚的转变。此中，C8:0、C15:1、C18:0脂肪酸质料分数均高于野生菌株，加倍是工程菌株DE1、DE中的不饱和脂肪酸组分C15:1、C18:2、C22:2质料分数均明显高于野生菌株。为揭示去饱和酶基因de1、de2单表达及共表达对油脂脂肪酸组分的影响，统计了工程菌株DE1、DE2、DE相看待野生菌株中饱和与不饱和脂肪酸的提升量。如图7所示，工程菌株中饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸含量均提升，饱和脂肪酸含量分辨提升72.26%、66.93%、123.21%，不饱和脂肪酸含量分辨提升112.18%、44.18%、134.30%，标明去饱和酶基因的表达有利于E.coli中脂肪酸组分的改观。

　　表面上，去饱和酶特异性地督促成熟脂肪酸中顺式双键的造成，将饱和状况下的脂肪酸去饱和，环节组织域和环节位点组成去饱和酶的活性中央并影响其活性，且分其它催化底物对催化速度也爆发必定的影响。有讨论标明，脂肪酸去饱和酶的类型、表达程度和活性决策了不饱和脂肪酸的定性和定量构成，非常去饱和酶的过表达能够督促细胞内单不饱和脂肪酸的富集和脂质积蓄，从而抵达改观脂肪酸组分的效益。本讨论通过对工程菌株相看待野生菌株中饱和与不饱和脂肪酸含量的提升量举行统计剖析，注通晓去饱和酶基因的表达有利于E.coli中脂肪酸组分的改观，加倍是不饱和脂肪酸含量的提升。表4总结了近年来酵母菌和E.coli中过表达去饱和酶基因惹起菌株不饱和脂肪酸组分和含量转变的讨论结果，可见去饱和酶看待脂肪酸组分的改观至合紧急，过表达分别源泉的去饱和酶基因看待高产油工程菌或非常组分工程菌的修筑拥有紧急运用代价和表面意旨。

　　正在E.coli BL21（DE3）中表达了来自产油核桃内生菌B.subtilis HB1310的去饱和酶基因，修筑了单基因表达菌株BL21（DE3）/pET-de1、BL21（DE3）/pET-de2及共表达菌株BL21（DE3）/pET-de，竣工了去饱和酶基因的高表达，有用督促了E.coli去饱和酶活性的提升，使脂肪酸积蓄量得以添补，提升了菌株油脂产量和含量，改观了脂肪酸组分，加倍使不饱和脂肪酸含量明显提升。本讨论可为产油脂工程菌的开荒和运用供应有代价的菌种源泉，对高效产油工程菌的修筑拥有必定的运用代价。

　　本文《过表达去饱和酶基因对大肠杆菌脂肪酸合成的影响》源泉于《食物科学》2023年45卷第2期72-78页，作家：叶 景，许思远，张 琴，钱 程食品，曹娟娟，赵 沛。DOI:10.7506/spkx0509-076。点击下方 阅读原文即可查看作品合连消息。

　　操演编纂：天津贸易大学生物身手与食物科学学院 梁雯菁；负担编纂：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片源泉于作品原文及摄图网。

　　为了帮帮食物及生物学科科技职员控造英文科技论文的撰写本领、提升SCI期刊收录的掷中率，归纳提拔我国食物及生物学科科技职员的高质料科技论文写作本事。《食物科学》编纂部拟定于2024年8月1—2日正在武汉举办“第11届食物与生物学科高程度SCI论文撰写与投初稿领研修班”，为期两天。

　　为提升我国食物养分与安静科技自立立异和食物科技财富维持本事，促使食物财富升级，帮力‘强健中国’战术，北京食物科学讨论院、中国食物杂志社、国际谷物科技学会（ICC）将与湖北省食物科学身手学会、华中农业大学、武汉轻工大学、湖北工业大学、中国农业科学院油料作物讨论所、中南民族大学、湖北省农业科学院农产物加工与核农身手讨论所、湖北民族大学、江汉大学、湖北工程学院、果蔬加工与品格调控湖北省中心测验室、武汉食物化妆品考验所、国度市集囚禁测验室（食用油质料与安静）、境况食物学教学部中心测验室配合举办“第五届食物科学与人类强健国际研讨会”。集会期间：2024年8月3—4日，集会地方：中国 湖北 武汉。

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